STUDI PREFORMULASI KUERSETIN : 
KELARUTAN INTRINSIK, KONSTANTA IONISASI DAN 
STABILITY INDICATING ASSAY

Syofyan

ABSTRACT

Quercetin, a chemical cousin of the glycoside rutin from Manihot esculenta Crantz , is appears to have many biologically active. Preformulation studies are usually associated for a new drug substances, would include intrinsic solubility, ionization constants (pKa) and stability indicating assay. The determination of solubility and ionization constants were calculated by phase solubility and potentiometric titration methods, respectively. The research was done by intrinsic solubiliy of quercetin  is  3,2 ± 0,07 μg/mL in HCl 0,1 N. The complexation of quercetin by β-cyclodextrin indicated an AL-type diagram with inclusion complex of 1:1 molar ratio and stability constant K is 403,58 M-1. Enhancement of solubility was 9-fold with the quercetin, but not efective to liquid and oral phamaceutical applications.  The pKa values are pKT1 = 7,30 ± 0,12 dan pKT2 = 8,63 ± 0,18. Method of analysis determined by HPLC with methanol-water-phosporic acid as mobile phase are not stability indicating assay 

I. PENDAHULUAN

Indonesia merupakan negara yang sangat kaya akan berbagai jenis biota tumbuhan tropis yang telah dimanfaatkan sejak turun temurun untuk memenuhi berbagai kebutuhan hidup seperti sebagai obat-obatan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kandungan tumbuhan berupa senyawa seperti alkaloid, flavonoid, fenol dan lain-lain telah memberikan beragam efek farmakologis yang baik  sehingga telah banyak digunakan dalam pengobatan (Syamsulhidayat, 1991; Arbain, 2004).
Tanaman ubi kayu (Manihot esculenta Crantz) misalnya, merupakan tanaman yang paling gampang ditemukan dan mudah dibudidayakan. Berbagai jenis kandungan kimia terutama dari jenis flavonoid dalam bentuk senyawa murni seperti rutin, kuersetin dan lain sebagainya telah banyak diisolasi dari tanaman ini terutama dari daunnya (Soediro et.al, 1984). Di antara jenis senyawa tersebut di atas, kuersetin ternyata memiliki banyak sekali aktivitas biologisnya. Data dari Natural Pruduct Alert (NAPRALERT (SM), 1997) dan publikasi lainnya menunjukkan bahwa bioaktivitas kuersetin sangat luas, diantaranya dapat berefek sebagai antioksidan, antibakteri, antiedema, antifungal, antiinflamasi, antitumor, antiulser, antiviral dan lain sebagainya, sehingga senyawa bioaktif kuersetin ini memberikan harapan sebagai bahan baku obat yang sangat potensial untuk dikembangkan.
Untuk itu perlu pengkajian lebih lanjut terhadap senyawa kuersetin ini sehingga dapat dikembangkan sebagai kandidat obat. Sebagai langkah awal yang perlu dilakukan dalam pengembangan kandidat obat ini adalah melakukan studi preformulasi yaitu suatu usaha mengkarakterisasi sifat fisikokimia senyawa obat (Ansel, 1989; Martin et.al, 1990). Menurut Wells (1988), dalam studi preformulasi ini, ada dua sifat dasar zat yang perlu sekali diketahui yaitu berupa data kelarutan intrinsik dan konstanta ionisasinya. 
Dari kajian awal terhadap berbagai literatur, data kelarutan intrinsik kuersetin sampai saat ini belum ditemukan publikasinya  meskipun telah diketahui bersifat praktis tidak larut dalam air (Anonim, 1983; Painter, 1998), sedangkan data konstanta ionisasinya meski telah dipublikasikan (Salter et.al, 1978; Sauerwald et al, 1998; Webb & Ebeler, 2004; Torreggiani et.al, 2005; van der Woude, 2006; Zenkevich et.al, 2006; Zenkevich et.al, 2007), tapi memperlihatkan nilai yang bervariasi dan ini diduga ada hubungannya dengan metode yang digunakan dalam mendapatkan senyawa murni kuersetin dari spesies tersebut di samping faktor-faktor lainnya. Patil et.al (1995) menyatakan bahwa konsentrasi flavonoid termasuk kuersetin dari suatu spesies akan dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti lokasi, tingkat pertumbuhan dan jenis tanah yang berbeda. 
Berbagai jenis spesies tanaman telah banyak dipublikasikan sebagai sumber penghasil kuersetin baik yang diisolasi secara langsung maupun hasil hidrolisis dari bentuk glikosidanya seperti rutin. Sementara itu kuersetin yang diperoleh dari hasil hidrolisis rutin yang terdapat pada spesies tanaman ubi kayu (Manihot esculenta Crantz) sendiri, sampai saat ini belum ditemukan publikasinya.
Karena itu, pada studi preformulasi ini akan difokuskan kepada penentuan kedua sifat dasar di atas. Dari sifat-sifat dasar ini, selanjutnya dilakukan usaha untuk meningkatkan sifat kelarutan dari kuersetin melalui metode pembentukan kompleks inklusi dengan senyawa β-siklodekstrin sehingga nantinya kuersetin diharapkan dapat efektif dibuat dalam bentuk sediaan larutan (Lachman et.al, 1989). Selain itu, juga dilakukan pengembangan suatu metode pengujian dengan menggunakan kromatografi cair berkinerja tinggi (KCKT). Metode pengujian ini selain harus memenuhi syarat validasi, juga harus mampu mendeteksi adanya produk hasil uraiannya yang dikenal dengan istilah stability indicating assay (Stewart & Tucker, 1986).

II. BAHAN DAN METODE

2.1.	Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Farmasi III dan Laboratorium Farmasi Fisika Jurusan Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Andalas, yang dimulai pada bulan Februari hingga Juni 2007.
2.2.	Bahan dan Alat
2.2.1.	Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah : kuersetin, β-siklodekstrin, fase gerak metanol-air-asam fosfat, kalium hidroksida, natrium hidroksida, asam klorida, etanol, metanol dan aquabidest.
2.2.2.	Alat
Alat-alat yang digunakan adalah: seperangkat alat KCKT, spektrofotometer UV-1601 (Shimadzu), FTIR, timbangan digital M-220 D (Denver Instrument), pH meter (Kent Eil 7020), pengukur titik leleh (Galenkamp), buret, pipet mikro, pipet ukur, labu Erlenmeyer, tabung reaksi, gelas ukur, labu ukur, magnetic stirerr, shaker, pipet gondok dan vial.
2.3.	Metode Penelitian
2.3.1.	Pemeriksaan Pendahuluan 
Pemeriksaan pendahuluan kuersetin meliputi pemeriksaan pemerian seperti bentuk dan warna, kelarutan, titik lebur dan  spektrum UV-Vis dan FTIR nya.

2.3.2.	Uji Kelarutan Intrinsik Kuersetin
2.3.2.1.	Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum Kuersetin
Larutan induk dibuat dengan menimbang 10 mg kuersetin, dilarutkan dengan etanol 30% sampai 100 mL. Dari larutan dipipet 10 mL, diencerkan dengan etanol ad 100 mL sehingga didapatkan kadar 1000 µg/100 mL (10 µg/mL). Serapan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 200-400 nm.

2.3.2.2.	 Pembuatan Kurva Kalibrasi Kuersetin
Satu seri konsentrasi larutan kuersetin dalam etanol dibuat dari larutan induk di atas, yaitu dengan konsentrasi : 4, 8, 10, 12 dan 14 g/mL. Kemudian serapannya diukur dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang serapan maksimum kuersetin yang didapat. Dari data ini persamaan regresi antara konsentrasi kuersetin dengan serapan dibuat.

2.3.2.3.	 Penentuan Kelarutan Intrinsik Kuersetin 
Metode yang digunakan adalah metode kelarutan jenuh dengan perbandingan fase obat-pelarut. Pelarut yang digunakan adalah air, HCL 0,1 N dan NaOH 0,1 N. Caranya adalah: 10 mL masing-masing larutan dipipet, dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL. Kuersetin ditambahkan sedikit demi sedikit dengan jumlah tertentu ke dalam labu ukur 100 mL tersebut sambil diaduk sampai ada bagian kuersetin yang tidak terlarut (sampai jenuh). Aduk dengan alat shaker selama 24 jam untuk mendapatkan kesetimbangan. Larutan disaring dan diukur serapannya pada panjang gelombang serapan maksimum kuersetin.
2.3.3.	Penentuan Konstanta Ionisasi (pKa) Kuersetin
	Alat potensiometer dipasang dan elektroda dicelupkan ke dalam larutan kuersetin sesuai skema. Larutan dititrasi dengan KOH 0,1 N secara perlahan. Campuran diaduk dengan magnetic stirerr, didiamkan dan dibiarkan sampai didapatkan pembacaan pH yang stabil. Penambahan pentiter KOH 0,1 N dilakukan tiap 0,1 mL, dibiarkan selama interval tertentu (20 atau 30 detik), lalu nilai pH larutan dibaca.

2.3.4.	Peningkatan Kelarutan Kuersetin 
Untuk meningkatkan kelarutan kuersetin, dilakukan dengan metode pembentukan kompleks inklusi dengan menggunakan pengompleks β-siklodekstrin. Caranya sama dengan uji kelarutan seperti di atas.
2.3.5.	Stability Indicating Assay 
2.3.5.1.	 Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) 
a.	Kondisi KCKT
Fase gerak yang digunakan adalah metanol-air-asam fosfat (50:49,8:0,2 v/v/v) dengan fase diamnya kolom C-18. Fase gerak sebelum digunakan, diawagaskan terlebih dahulu.
b.	Larutan induk kuersetin
Sebanyak 10 mg kuersetin ditimbang, dilarutkan dengan fase gerak dalam labu ukur sampai 100 mL sehingga didapat konsentrasi 100 μg/mL.
c.	Uji presisi
Caranya, larutan kuersetin 20 µg/mL diambil, disaring dan diinjeksikan ke sistem KCKT, dielusi dengan fase gerak. Penyuntikan dilakukan 5 kali.
d.	Uji linearitas
Dari larutan induk, pengenceran dibuat dengan cara masing-masing dipipet 2 , 4, 6, 8 dan 10 ml ke dalam labu ukur 10 mL. Larutan dicukupkan dengan fase gerak sampai tanda batas sehingga didapat konsentrasi masing-masing 20, 40, 60, 80 dan 100 µg/mL. Semua larutan standar disaring dengan penyaring millipore dengan ukuran pori 0,45 µm. Masing-masing larutan diinjeksikan ke dalam sistem KCKT. Serapan dideteksi pada panjang gelombang serapan maksimum kuersetin. Kemudian kurva hubungan antara konsentrasi dengan luas area kuersetin dibuat. Dari persamaan regresi yang diperoleh, ditentukan koefisien korelasinya (r).
e.	Penentuan LOD dan LOQ
Dari persamaan yang diperoleh dalam uji linearitas,  maka nilai LOD dan LOQ dapat diperoleh yaitu dengan cara :

2.3.5.2.	Stability Indicating Assay (Lucida et.al, 2000)
Larutan kuersetin dalam etanol 30% dipanaskan selama 2 jam (50ºC) kemudian kadar kuersetin tersisa ditentukan dengan KCKT. Sejumlah 5 mL dari larutan ini kemudian dispike yaitu dengan menambahkan 5 mL larutan baru kuersetin dengan konsentrasi yang diketahui. Cara pembuatan 5 mL larutan yang diketahui konsentrasinya ini adalah : konsentrasi awal kuersetin (sama dengan 100%), ditambah dengan persentase jumlah kuersetin yang hilang pada waktu pemanasan. Kadar kuersetin yang telah dispike ini ditentukan kembali dengan menggunakan KCKT. Kadar perolehan kembali kuersetin dihitung.
III.  HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1.	 Hasil Penelitian
3.1.1.	Pemeriksaan pendahuluan
Pemeriksaan pendahuluan adalah berupa pemeriksaan terhadap kuersetin dengan hasil seperti dalam Tabel 1.
Tabel 1.  Hasil pemeriksaan kuersetin.
No.	Pemeriksaan	Rujukan	Persyaratan	Pengamatan	
1	Pemerian	
	a. Bentuk	Anonim, 1983	Serbuk	Serbuk	
	b. Warna	Anonim, 1983	Kuning 	Kuning	
2	Kelarutan	
	a. Dalam air	Anonim, 1983	Praktis tidak larut	4,5 μg/mL	
	b. Dalam etanol abs	Anonim, 1983	4,0 mg/mL	4,0 mg/mL	
	c. Dalam etanol 30 %	Zenkevich et.al, 2007	0,28 mg/mL	0,28 mg/mL	
	d. Dalam etanol 70 %	Zenkevich et.al, 2007	3,5 mg/mL	3,5mg/mL 	
3	Titik lebur 	Painter, 1998	> 300 ºC	305 ºC	
4	Panjang gelombang serapan maksimum dalam etanol	Anonim, 1983	258 dan 375 nm	258 dan 372 nm	

	Hasil pemeriksaan spektrum FTIR terlihat seperti dalam Gambar 1 dan Tabel 2 berikut:
A

B

Gambar 1. Spektrum FTIR kuersetin, A. Kuersetin sampel; B. Kuersetin pembanding (Anonim, 2007)

Tabel 2. Perbandingan puncak spektrum FTIR kuersetin sampel dengan pembanding.

Pembanding
(cm-1)	Sampel
(cm-1)	Keterangan	
3407	3401	s 4'-OH	
1660	1663	s C=O	
1611	1611	s cincin (A dan B)	
1562	1563	s cincin B	
1520	1521		
1450	1451	s cincin B, s C4'-OH, s C3'-OH,	
1382	1381	s cincin B, s C2-C1', s C9-C10'	
1319	1317		
1263	1258	s cincin B, s C3-C4, s C4-C10	
1210	1219		
1200	1197	s cincin A, b(C2'-C3'-C4'), b(C5'-C6'-C1')	
1169	1171	s cincin B	
1132	1131	s C3-C4, s C10-C5, s C8-C7	
1093	1091		
1016	1013		
1001	977		
942	940		
879	882		
866	865		
843	840		
827	824		
796	795		
723	722		
706	702		
687	682		
639	638		
604	602		
	Keterangan : s = stretching (lekukan), b = bending (uluran)

2.1.2.	Kelarutan intrinsik
Pemeriksaan penentuan panjang gelombang serapan maksimum kuersetin dalam pelarut etanol 30% menunjukkan dua panjang gelombang maksimum yaitu 374,4 dan 257,2 nm seperti dalam Gambar 2 berikut :

Gambar 2.  Panjang gelombang serapan maksimum kuersetin dalam etanol 30%
		Dalam menetapkan kadar kuersetin yang terlarut digunakan kurva baku secara spektrofotometri pada panjang gelombang serapan maksimum. Kurva baku ini menggambarkan hubungan antara kadar kuersetin (μg/mL) dengan serapan seperti tersaji dalam Tabel 3 dan Gambar 3 dan 4. Dari kurva kalibrasi ini, persamaan kurva kalibrasi yang diperoleh yaitu Y = 0,0559X – 0,0043, r = 1 untuk panjang gelombang 374,4 nm serta Y = 0,0563X – 0,0126, r = 0,9999 untuk panjang gelombang 257,2 nm
Tabel 3.  Penetapan kurva kalibrasi kuersetin dalam pelarut etanol 30%.
No	Konsentrasi
(μg/mL)	Serapan 1
( λ1 374,4 nm)	Serapan 2
(λ2 257,2 nm)	
1	4	0,219	0,212	
2	8	0,443	0,440	
3	10	0,555	0,547	
4	12	0,666	0,664	
5	14	0,778	0,775	

Gambar 3. Kurva kalibrasi kuersetin dalam pelarut etanol 30% pada panjang   gelombang 374,4 nm.

Gambar 4. 	Kurva kalibrasi kuersetin dalam pelarut etanol 30% pada panjang gelombang 257,2 nm.

	Hasil penentuan kelarutan kuersetin dalam air, HCL 0,1 N dan NaOH 0,1 N dapat dilihat pada Tabel 4, 5 dan 6 serta Gambar 5, 6 dan 7 berikut :

	    Tabel 4.  Kelarutan kuersetin dalam air
No	Serapan	Konsentrasi (μg/mL)	
Kuersetin 10 mg	
1	0,279	5,0680	
2	0,285	5,1753	
3	0,281	5,1038	
Rata-rata	0,282	5,1216	
Standar Deviasi (SD)	0,0547	
Koefisien Variasi (KV)	1,1%	
Kuersetin 20 mg	
1	0,321	5,8193	
2	0,312	5,6583	
3	0,32	5,8014	
Rata-rata	0,318	5,7657	
Standar Deviasi (SD)	0,0882	
Koefisien Variasi (KV)	1,5%	
Kuersetin 30 mg	
1	0,348	6,3023	
2	0,351	6,3560	
3	0,344	6,2308	
Rata-rata	0,348	6,3023	
Standar Deviasi (SD)	0,0628	
Koefisien Variasi (KV)	1,0%	

Gambar 5.  Kurva kelarutan kuersetin dalam berbagai rasio fase kuersetin-air 

		    Tabel 5. Kelarutan kuersetin dalam HCl 0,1 N.
No	Serapan	Konsentrasi (μg/mL)	
Kuersetin 10 mg	
1	0,195	3,5653	
2	0,201	3,6726	
3	0,199	3,6369	
Rata-rata	0,198	3,6249	
Standar Deviasi (SD)	0,0547	
Koefisien Variasi (KV)	1,5%	
Kuersetin 20 mg	
1	0,229	4,1735	
2	0,233	4,2451	
3	0,228	4,1556	
Rata-rata	0,230	4,1914	
Standar Deviasi (SD)	0,0473	
Koefisien Variasi (KV)	1,1%	
Kuersetin 30 mg	
1	0,257	4,6744	
2	0,252	4,5850	
3	0,249	4,5313	
Rata-rata	0,253	4,5969	
Standar Deviasi (SD)	0,0723	
Koefisien Variasi (KV)	1,6%	

Gambar 6.  Kurva kelarutan kuersetin dalam berbagai rasio fase kuersetin-HCL0,1N

		    Tabel 6. Kelarutan kuersetin dalam NaOH 0,1 N.
No	Serapan	Konsentrasi (μg/mL)	
Kuersetin 50 mg	
1	0,499	4501,7889	
2	0,487	4394,4544	
3	0,485	4376,5653	
Rata-rata	0,490	4424,2695	
Standar Deviasi (SD)	67,7270	
Koefisien Variasi (KV)	1,5%	
Kuersetin 60 mg	
1	0,522	4707,5134	
2	0,513	4627,0125	
3	0,528	4761,1807	
Rata-rata	0,521	4698,5689	
Standar Deviasi (SD)	67,5298	
Koefisien Variasi (KV)	1,4%	
Kuersetin 70 mg	
1	0,545	4913,2379	
2	0,551	4966,9052	
3	0,534	4814,8479	
Rata-rata	0,543	4898,3304	
Standar Deviasi (SD)	77,1170	
Koefisien Variasi (KV)	1,6%	
		     Catatan : Faktor pengenceran 500

Gambar 7.  	Kurva kelarutan kuersetin dalam berbagai rasio fase kuersetin-NaOH 0,1N

	Data (Gambar 5, 6 dan 7) memperlihatkan peningkatan kelarutan kuersetin dengan meningkatnya rasio fase obat – pelarut yang memberikan persamaan linear sebagai berikut : dalam pelarut air : Y = 0,5903X + 4,5492; r = 0,9986, dalam pelarut HCL Y = 0,486X + 3,1658; r = 0,9954 dan dalam pelarut NaOH, Y = 237,03X + 3251,5; r = 0,9959. Dari persamaan ini, setelah diekstrapolasikan kepada nilai X = 0, maka nilai kelarutan jenuh kuersetin yang diperoleh adalah sebagai berikut, di dalam air 4,5 ± 0,06 μg/mL; di dalam HCl 0,1 N 3,2 ± 0,07 μg/mL dan di dalam NaOH 0,1 N 3.251,5 ± 77,12 μg/mL atau 3,2 ± 0,08 mg/mL. Nilai kelarutan jenuh kuersetin dalam HCl 0,1 N adalah sama dengan nilai kelarutan intrinsiknya.
	Untuk meningkatkan kelarutan kuersetin yang terbatas dalam media air, maka dapat dilakukan dengan metode pembentukan kompleks inklusi dengan senyawa β-siklodekstrin. Hubungan antara kadar  β-siklodekstrin dengan kelarutan kuersetin, dapat dilihat dalam Tabel 7 dan Gambar 8.

Tabel 7.  Penetapan konstanta kompleks kuersetin-β Siklodekstrin
	
Konsentrasi	Serapan	Faktor	Konsentrasi 	Konsentrasi	
β-Siklodekstrin	 	Pengenceran	Kuersetin	Kuersetin	
(M)	 	 	(μg/mL)	(x 10 -5 M)	
0	0,279	1	5,0680	1,4982	
 	0,285	1	5,1753	1,5299	
 	0,281	1	5,1038	1,5088	
Rata-rata	0,282	1	5,1216	1,5141	
Standar deviasi (SD)	0,0547	0,016	
Koefisien Variasi (KV)	1,1 %	1,1 %	
0,004	0,194	4	14,1896	4,1948	
 	0,199	4	14,5474	4,3005	
 	0,198	4	14,4758	4,2794	
Rata-rata	0,197	4	14,4043	4,2582	
Standar deviasi (SD)	0,1893	0, 056	
Koefisien Variasi (KV)	1,3 %	1,3 %	
0,008	0,349	3,3	20,8567	6,1657	
 	0,357	3,3	21,3290	6,3053	
 	0,347	3,3	20,7386	6,1308	
Rata-rata	0,351	3,3	20,9748	6,2006	
Standar deviasi (SD)	0,3124	0, 092	
Koefisien Variasi (KV)	1,5 %	1,5 %	
0,012	0,498	3,3	29,6528	8,7660	
 	0,507	3,3	30,1841	8,9231	
 	0,51	3,3	30,3612	8,9754	
Rata-rata	0,505	3,3	30,0660	8,8882	
Standar deviasi (SD)	0,3687	0, 109	
Koefisien Variasi (KV)	1,2 %	1,2 %	
0,016	0,458	5	41,3506	12,2241	
 	0,449	5	40,5456	11,9862	
 	0,452	5	40,8140	12,0655	
Rata-rata	0,453	5	40,9034	12,0919	
Standar deviasi (SD)	0,4099	0, 121	
Koefisien Variasi (KV)	1,0 %	1,0 %	
0,02	0,52	5	46,8962	13,8636	
 	0,515	5	46,4490	13,7313	
 	0,507	5	45,7335	13,5198	
Rata-rata	0,514	5	46,3596	13,7049	
Standar deviasi (SD)	0,5865	0, 173	
Koefisien Variasi (KV)	1,3 %	1,3 %	

Gambar 8.  Diagram fase kelarutan kuersetin - β-siklodekstrin.
	Hubungan antara konsentrasi β-siklodekstrin dengan kelarutan kuersetin seperti gambar di atas, menghasilkan garis yang linear dan disebut tipe AL (tipe 1:1) dengan persamaan berikut: Y = (6,2246 x 10-3)X + (1,5520 x 10-5). Dari persamaan ini, diperoleh  nilai intersep A = (1,5520 x 10-5) dan slope B = (6,2246 x 10-3), sehingga dengan menggunakan persamaan 20, diperoleh nilai tetapan stabilitas kompleks (K) sebesar 403,58 M-1. 

2.1.3.	Konstanta ionisasi
Penentuan konstanta ionisasi dari kuersetin dilakukan dengan mengunakan metode potensiometri. Kuersetin dilarutkan dalam berbagai konsentrasi etanol yaitu 50, 60 dan 70%. Hasil pemeriksaan konstanta ionisasi ini dapat dilihat dari Gambar 9 s.d. 14, sedangkan persamaan kurva yang dihasilkan adalah sebagai berikut: untuk pKM-etanol 50% Y = (1,3567 x 108)X – (1,3052 x 10-10), r = 0,9980; pKT-etanol 50% Y = (1,3565 x 108)X – (1,3021 x 10-10), r = 0,9980; pKM-etanol 60% Y = (1,7825 x 108)X – (0,6020 x 10-10), r = 0,9989; pKT-etanol 60% Y = (1,7822 x 108)X – (0,5999 x 10-10), r = 0,9989; pKM-etanol 70% Y = (2,8866 x 108)X – (0,4020 x 10-10), r = 0,9990; pKT 70% Y = (2,8862 x 108)X – (0,4009 x 10-10), r = 0,9990.

Gambar 9.     Kurva hubungan antara {H+}2 2F/(1-F) terhadap {H}(1-F)/(2-F) pada persamaan 82 untuk penentuan pKM kuersetin dalam pelarut etanol 50%.

Gambar 10. Kurva hubungan antara [H+]2 2F’/(1-F’) terhadap [H](1-F’)/(2-F’) pada persamaan 97 untuk penentuan pKT kuersetin dalam pelarut etanol 50%.

Gambar 11.  	Kurva hubungan antara {H+}2 2F/(1-F) terhadap {H}(1-F)/(2-F) pada persamaan 82 untuk penentuan pKM kuersetin dalam pelarut etanol 60%.

Gambar 12. Kurva hubungan antara [H+]2 2F’/(1-F’) terhadap [H](1-F’)/(2-F’) pada persamaan 97 untuk penentuan pKT kuersetin dalam pelarut etanol 60%.

Gambar 13. 	Kurva hubungan antara {H+}2 2F/(1-F) terhadap {H}(1-F)/(2-F) pada persamaan 82 untuk penentuan pKM kuersetin dalam pelarut etanol 70%.

Gambar 14. Kurva hubungan antara [H+]2 2F’/(1-F’) terhadap [H](1-F’)/(2-F’) pada persamaan 97 untuk penentuan pKT kuersetin dalam pelarut etanol 70%.

	Dari gambar di atas, dapat ditetapkan pKa campuran dan pKa termodinamika kuersetin dalam berbagai konsentrasi etanol, seperti dalam Tabel 8.
Tabel 8. Penetapan pKa kuersetin dalam berbagai kadar etanol	
					
Etanol	pKa Campuran	pKa Termodinamika	
	pKM1	pKM2	pKT1	pKT2	
50%	8,13249386	9,884322935	8,13245272	9,88546398	
60%	8,251037	10,22042515	8,25099998	10,22202901	
70%	8,46038031	10,39579555	8,46035087	10,39700599	

Untuk menentukan nilai pKa termodinamika kuersetin pada konentrasi etanol 0%, maka dibuat kurva hubungan antara berbagai kosentrasi etanol dengan nilai pKT yang didapat seperti terlihat pada Gambar 15 dan 16.

Gambar 15.  Penentuan pKT1 kuersetin

Gambar 16.  Penentuan pKT2 kuersetin

	Kurva di atas memberikan persamaan berikut : Y = 1,6395X + 7,2976, r = 0,9875 untuk pKT1 dan Y = 2,5577X + 8,6335, r = 0,9838 untuk pKT2, sehingga jika diekstrapolasi kekonsentrasi etanol 0%, akan didapat nilai pKT1 = 7,30 ± 0,12 dan pKT2 = 8,63 ± 0,18.

2.1.4.	Stability indicating assay
Metode analisis yang digunakan adalah KCKT dengan fase gerak metanol-air-asam fosfat (50 : 49,8 : 0,2,, v/v//) memperlihatkan hasil validasi seperti yang tercantum dalam Tabel 9, 10 dan 11 serta Gambar 17. Pada uji persisi, nilai KV diperoleh 1% dan pada uji linearitas diperoleh persamaan garis Y = 10083X – 638,39 , r = 0,9954.
Tabel 9.  Uji presisi.
	
No	Waktu retensi	Luas puncak	
 	(Menit)	 	
1	4,6	45953	
2	4,592	44973	
3	4,55	45259	
4	4,567	45167	
5	4,581	45972	
Rata-rata	45464,8	
SD	465,9659	
KV (%)	1,0	

Tabel 10.  Uji linearitas.
	
No	Konsentrasi	Luas Puncak	
	(μg/mL)		
1	5,2	45972	
2	8,32	85032	
3	10,4	106804	
4	12,48	126518	
5	16,64	174531	
6	20,8	201833	

Gambar 17.  Kurva uji linearitas 

Tabel 11.  Penetapan LOD & LOQ.
	
No	Konsentrasi	Luas Puncak	 	 	
 	(μg/mL)	(Yi)	Ŷi	(Ŷi - Yi)²	
1	5,2	45972	51793,21	33886485,86	
2	8,32	85032	83252,17	3167794,829	
3	10,4	106804	104224,81	6652221,056	
4	12,48	126518	125197,45	1743852,302	
5	16,64	174531	167142,73	54586533,59	
6	20,8	201833	209088,01	52635170,1	
Σ (Ŷi - Yi)²	152672057,7	
S y/x	12356,05349	
LOD	3,6763 μg	
LOQ	12,2543 μg	
	
	Sedangkan pada pengujian Stability Indicating Assay diperoleh pola kromatogram seperti pada Gambar 18. Dari gambar ini terlihat adanya dua puncak yaitu puncak 1 (waktu retensi 4,5 menit) yang dihitung sebagai kuersetin dan puncak 2 (waktu retensi 6,7 menit) sebagai impurities. Perhitungan terhadap kadar kuersetin diperoleh hasil: sebelum dispike sebesar 10,34% dan setelah dispike sebesar 81,07%.

2

1

A. 

1

2

B. 

1

2

C. 

2

1

D

Gambar 18.  Pola kromatogram kuersetin: A. Larutan standar; B. Larutan sampel sebelum diuraikan; C. Larutan sampel setelah diuraikan dan tidak dispike; D. Larutan sampel setelah diuraikan dan dispike. (1. Kuersetin, 2. Impurities)

3.2.  Pembahasan
Hasil pemeriksaan pendahuluan terhadap kuersetin memperlihatkan dua panjang gelombang dalam daerah UV-Vis seperti flavon dan flavonol pada umumnya. Panjang gelombang pita I adalah 372 nm yang menggambarkan serapan pada cincin B (sistem sinamoil) dan panjang gelombang pita II pada 258 nm karena cincin A (sistem benzoil) seperti terlihat pada gambar. (Harborne et.al, 1982; Markham, 1988; Torreggiani et.al, 2005). Sementara hasil pemeriksaan FTIR menunjukkan pola spektrum yang hampir sama antara kuersetin sampel dengan pembanding, sehingga dapat dinyatakan bahwa sampel memang merupakan senyawa kuersetin. Selain itu, dari puncak yang muncul juga dapat terlihat adanya gugus karbonil pada 1663 cm-1 dan substituen 4'-OH pada 3401 cm-1 (Harborne et.al, 1982; Torreggiani et.al, 2005).

Gambar 19.  Struktur yang menggambarkan pola kromofor pada kuersetin
Nilai kelarutan jenuh yang diperoleh adalah sebagai berikut, di dalam air 4,5 ± 0,06 μg/mL; di dalam HCl 0,1 N 3,2 ± 0,07 μg/mL dan di dalam NaOH 0,1 N 3.251,5 ± 77,12 μg/mL atau 3,2 ± 0,08 mg/mL. Dari data kelarutan ini terlihat bahwa kuersetin lebih besar kelarutannya di dalam basa yang berarti menunjukkan bahwa kuersetin adalah senyawa asam lemah. Sedangkan nilai kelarutan jenuhnya di dalam asam, merupakan nilai kelarutan intrinsik kuersetin dimana pada suasana asam, kuersetin sebagian besar berada  dalam bentuk molekulnya (tidak terion) sehingga sedikit ditemukan dalam bentuk terion yang terlarut. Dari grafik terlihat, peningkatan kelarutan kuersetin dengan meningkatnya perbandingan fasa obat-pelarut. Hal ini dimungkinkan terjadi karena terdapat sejumlah senyawa yang lain (pengotor), yang bersifat lebih larut dalam air dibandingkan kuersetin (Wells, 1988). Dalam hal ini, karena kuersetin adalah hasil hidrolisis dari rutin yang diisolasi dari daun ubi kayu, maka diduga kuat masih ada impurities (pengotor) dari proses isolasi dan hidrolisisnya.
Kelarutan kuersetin yang rendah dalam media berair, tentunya menjadi halangan dalam memformulasinya dalam bentuk sediaan larutan, di samping faktor stabilitasnya. Untuk itu, perlu dilakukan usaha peningkatan kelarutan kuersetin yaitu salah satunya dengan metode pembentukan kompleks (James, 1986; Martin et.al, 1990). Kompleks yang digunakan adalah kompleks inklusi. Zat atau kuersetin akan terperangkap dalam ruang pengompleks yaitu β-siklodekstrin. 
β-siklodekstrin seperti dalam Tabel 2, memiliki diameter rongga sebesar 6,0-6,5 Ǻ. Sedangkan kuersetin jika dihitung secara teoritik ukuran spatial molekulnya berdasarkan gambar 26 di atas, akan mempunyai ukuran dengan panjang 14,344 – 15,967 Ǻ dan lebar cincin A 3,940-7,687 Ǻ, cincin B 6,074-6,460 Ǻ dan cincin C 2,692-5,410 Ǻ. Dilihat dari ukuran ini, memang terlihat bahwa cincin B dan C dan sebagian cincin A dapat masuk ke dalam rongga β-siklodekstrin seperti yang dinyatakan oleh Zheng et.al, 2005. Volume β-siklodekstrin menurut Szejtli (1997) adalah 262 Ǻ3, sehingga jika diameternya 6,5 Ǻ maka dapat diperoleh tinggi rongga β-siklodekstrin yang berupa silinder sekitar 7,9 Ǻ. Dari pehitungan ini, diperkirakan kuersetin yang masuk ke dalam rongga β-siklodekstrin adalah separuhnya yaitu dari cincin B sampai sebagian cincin C.
Berdasarkan pengujian yang dilakukan, diperoleh hubungan yang linear antara kadar β-siklodekstrin dengan kelarutan kuersetin dengan persamaan Y = 0,0062X + 0,000015; r = 0,9972. Linearitas ini menunjukkan bahwa tipe kurva yang terjadi adalah tipe AL dimana mengindikasikan terbentuknya kompleks 1:1 antara kuersetin dengan β-siklodekstrin. Dari persamaan di atas, diperoleh harga tetapan stabilitas kompleks kuersetin adalah sebesar 403,58 M-1. Nilai ini jauh lebih kecil dari nilai tetapan kompleks yang diperoleh dari flavonoid pinostrobin yaitu 112.500 M-1 (Isadiartuti et.al, 2001). Menurut Szejtli (1997), nilai tetapan kompleks yang baik berada antara 100 – 10.000 M-1, karena jika nilainya lebih tinggi maka dapat mengurangi bioavailibilitasnya, dimana kompleks praktis tidak diserap.
Peningkatan kelarutan kuersetin melalui kompleks inklusi dengan β-siklodekstrin pada konsentrasi β-siklodekstrin tertinggi 0,02 M adalah sebesar sembilan kalinya. Kecilnya peningkatan kelarutan kuersetin dalam β-siklodekstrin ini, diduga ada hubungannya dengan ukuran kuersetin seperti yang dijelaskan tadi. Namun jika dilihat dari kelarutannya yaitu sebesar 46,36 μg/mL, maka berarti belum memenuhi syarat kelarutan untuk calon obat. Menurut Wells (1988), jika kelarutan obat kecil dari 1% (10 mg/mL), maka senyawa tersebut akan memiliki masalah dalam hal absorpsi. Karena itu, dapat dinyatakan bahwa β-siklodekstrin tidak efektif digunakan dalam meningkatkan kelarutan kuersetin. 
Penggunaan metode potensiometri dilakukan karena dari strukturnya, kuersetin kemungkinan memiliki nilai pKa yang berdekatan sehingga pada penentuan secara spektrofotometri, ionisasi saling mempengaruhi pembacaan serapan pada berbagai pH yang diamati yang berakibat kepada sulitnya diperoleh titik isosbestik. Metode titrasi potensiometri memberikan sensitivitas maksimum untuk senyawa-senyawa dengan harga pKa dalam rentang 3 – 10, tetapi seringkali dihalangi oleh pengendapan dari bentuk tidak terion selama titrasi tersebut, karena suatu konsentrasi obat yang tinggi biasanya diperlukan untuk mendapatkan kurva titrasi yang bermakna. Untuk mencegah pengendapan dan sekaligus meningkatkan kelarutan kuersetin, maka suatu kosolven seperti etanol dapat dicampurkan untuk menjaga kelarutan yang cukup bagi jenis zat yang tidak terion. Nilai pKa diperoleh dari ekstrapolasi nilai pKa pada berbagai konsentrasi etanol ke titik nol (Albert et.al, 1971; Lachman et.al, 1989; Pandit & Sisco, 1989).
Hasil penentuan nilai pKa yang diperoleh adalah pK1 adalah 7,30 ± 0,12 dan pK2 sekitar 8,63 ± 0,18. Hasil ini merupakan ekstrapolasi nilai pKa dalam larutan yang mengandung etanol berbagai konsentrasi ke konsentrasi etanol 0% dan merupakan pKa termodinamika (pKT1 dan pKT2), karena konsentrasi dihitung sebagai aktivitas dengan mempertimbangkan kekuatan ionik yang ada. Nilai ini hampir sama dengan nilai pKa campuran yang diperoleh yaitu pKM1 dan pKM2 karena larutan kuersetin yang dibuat cukup encer sehingga memberikan hasil tidak jauh berbeda (Albert et.al, 1971).  Kedua nilai pKa berada dalam rentang kecil dari 2,7 unit pKa. Ini menunjukkan bahwa proses ionisasi terjadi secara tumpang tindih (overlapping), artinya titik akhir ekuivalen ionisasi pertama tidak jelas karena ionisasi kedua dimulai sebelum gugus lain terion sempurna (Albert et.al, 1971). 
Penelusuran literatur menunjukkan, harga pKa kuersetin yang berbeda-beda setiap publikasi seperti yang tercantum dalam Tabel 12 berikut ini :
Tabel 12. Nilai pKa kuersetin dari berbagai publikasi
No	Nilai pKa	Posisi ionisasi	Rujukan	
1	7,3 dan 9,15	-	Sauerwald et.al, 1998	
2	6,7 dan 9,0	7-OH dan 4'-OH	Torreggiani et.al, 2005	
3	7	7-OH	Webb et.al, 2004	
4	7,03	4'-OH	van der Woode, 2006	
5	7,1	7-OH	Zenkevich et.al, 2006	
6	7,3 ± 0,1	7-OH	Zenkevich et.al, 2007	
7	7,65	-	Salter et.al, 1978	

Dari tabel terlihat, ditemukan hanya dua literatur yang mempublikasikan adanya dua nilai pKa kuersetin. Sedangkan literatur lain mempublikasikan satu nilai pKa. Dari data ini juga menunjukkan adanya perbedaan terhadap posisi ionisasi yang pertama terjadi pada kuersetin. Sebagian besar menyatakan bahwa ionisasi pertama kuersetin adalah pada posisi 7-OH di cincin A dan kemudian diikuti oleh gugus 4'-OH. 
Berdasarkan fakta ini, maka kuat dugaan bahwa pada daerah yang diamati yaitu sampai pH 10, kemungkinan hanya dapat mengamati dua tahap ionisasi yang tumpang tindih sehingga memberikan nilai pKa berdekatan, dimana nilai pK1 yang diperoleh sebesar 7,30 ± 0,12  berasal dari ionisasi pada cincin A di posisi 7-OH dan nilai pK2 sebesar 8,63 ± 0,18 berasal dari ionisasi cincin B di posisi 4'-OH. 
Dugaan bahwa cincin A yang pertama kali terionisasi yaitu pada posisi 7-OH dapat dijelaskan sebagai berikut: oksigen yang lebih elektronegatif pada gugus 4-keto akan cenderung menarik elekrton dan membentuk atom muatan parsial positif pada atom C4, sehingga terjadi delokalisasisi muatan yang selanjutnya dapat menarik elektron pada ikatan π pada cincin A. Sementara itu, atom O dengan muatan parsial negatif pada posisi C4 tadi, selanjutnya akan membentuk ikatan hidrogen intramolekuler dengan atom H pada gugus OH di posisi C5 (Kooter et.al, 2002) sehingga  akan menstabilkan ion fenoksida ini. Akibatnya, gugus 5-OH sulit terdeprotonasi. Struktur resonansi dari anion fenoksida yang dihasilkan pada posisi 7-OH ini dimana delokalisasi yang terjadi melibatkan cincin A dan cincin C dapat dijelaskan seperti Gambar 23.

Gambar 23.  Struktur resonansi ion fenoksida yang terbentuk melalui kehilangan proton dari OH pada posisi 7.

Pada cincin B, posisi 4'-OH berada pada posisi para, dimana resonansi ion fenoksida lebih mungkin terjadi daripada posisi meta (3'-OH) sehingga gugus 4'-OH lebih asam dan terionisasi lebih dahulu seperti pada Gambar 24. Adanya halangan ruang kemungkinan akan menyebabkan lemahnya resonansi sistem konjugat π pada substituen aril (cincin B) dengan fragmen γ benzopiran sehingga keasaman gugus 4'-OH pada cincin B menjadi lemah dibandingkan dengan gugus 7-OH pada cincin A (Zenkevich & Pimenov, 2003).  

Gambar 24.  Struktur resonansi ion fenoksida yang terbentuk melalui kehilangan proton dari OH pada posisi 4'.
Uraian di atas menegaskan bahwa nilai pKa yang diperoleh dari penelitian ini adalah pKT1 = 7,30 ± 0,12 untuk ionisasi pada 7-OH dan pKT2 = 8,63 ± 0,18 untuk ionisasi pada 4'-OH.
Penggunaan metode analisis dilakukan menggunakan KCKT dengan fase gerak berbeda-beda. Ada empat jenis fase gerak yang dicoba yaitu metanol-asetonitril-air 40:15:45 v/v/v (Zu et.al, 2006), asetonitril 25 % dalam NaH2PO4 0,025 M (Tokusoglu et.al, 2003), metanol-air-asam fosfat 50 : 49,8 : 0,2 v/v/v (Zhou et.al, 1997) dan asetonitril-tetrahidrofuran-asam fosfat 0,2 % 14,3 : 1,7 : 84 v/v/v (Anonim, 2004). Di antara ke empat jenis fase gerak tersebut, yang memberikan hasil pemisahan yang baik dan memenuhi syarat validasi adalah dengan fase gerak metanol-air-asam fosfat 50:49,8:0,2 v/v/v dengan nilai koefisien variasi yang diperoleh pada uji presisi sebesar 1%, linearitas y = 10083x -638,39, r = 0,9954 dan LOD = 3,68 μg; LOQ = 12,25 μg pada rentang 5,2 – 20,8 μg/mL.
Dari gambar kromatogram kuersetin terlihat adanya dua puncak yang ditemukan. Adanya dua puncak ini menunjukkan bahwa selain kuersetin, diduga masih ada senyawa (pengotor) lain yang terdapat dalam sampel kuersetin. Puncak ke-1 muncul pada waktu retensi 4,5 menit dan puncak ke-2  pada 6,7 menit. Yang dihitung sebagai kuersetin adalah puncak ke-1 sebagaimana terlihat dalam Gambar 23. 
Metode analisis kemudian diuji untuk melihat apakah merupakan stability indicating assay untuk kuersetin. Analisis KCKT larutan kuersetin dalam etanol 30% yang telah dipanaskan selama 2 jam (50ºC) menunjukkan kadar kuersetin tersisa sebesar 10,34%. Dari kromatogram, terlihat puncak ke-3 pada waktu retensi 9,1 menit yang diduga bisa saja merupakan hasil urai kuersetin. Atau hasil urai muncul pada waktu retensi yang sama dengan kuersetin. Sebab itu untuk mengujinya, larutan dispike dengan menambahkan 5 mL larutan kuersetin konsentrasi 189,66% kepada 5 mL larutan kuersetin yang telah dipanaskan tadi (konsentrasi 10,34%). Dari campuran kedua larutan ini, idealnya konsentrasi kuersetin yang ditemukan adalah pada rentang 100 ± 4%. Jika ada puncak hasil urai kuersetin yang muncul pada waktu retensi kuersetin, akan memberikan kadar kuersetin yang lebih besar dari 104% (Lucida et.al, 2000). Namun, hasil analisis kembali dengan KCKT terhadap campuran ini diperoleh konsentrasi kuersetin jauh lebih kecil (81,07%). Kuersetin yang ditambahkan diduga terbagi menjadi dua puncak (waktu retensi 4,6 dan 6,7 menit) sebagaimana terlihat pada Gambar 23 sehingga perhitungan dengan hanya menggunakan puncak ke-1 pada waktu retensi 4,6 menit menjadi kurang tepat. Dengan hasil ini dapat dinyatakan bahwa metode analisis menggunakan fase gerak metanol-air-asam fosfat 50:49,8:0,2 v/v/v belum bersifat stability indicating assay.
 
IV.  KESIMPULAN DAN SARAN

4.1.	Kesimpulan
Dari penelitian yang dilakukan dapat disimpulkan sebagai berikut :
1.	Kelarutan intrinsik kuersetin dalam HCl 0,1 N adalah 3,2 ± 0,07 μg/mL.
2.	Kuersetin membentuk kompleks 1:1 dengan β-siklodekstrin dengan tetapan stabilitas kompleks 403,58 M-1.  Kompleks inklusi ini dapat meningkatkan kelarutan kuersetin sebanyak sembilan kalinya, namun belum efektif diaplikasikan dalam pembuatan sediaan larutan kuersetin.
3.	Nilai konstanta ionisasi kuersetin adalah pKT1 = 7,30 ± 0,12 dan pKT2 = 8,63 ± 0,18.
4.	Metode analisis menggunakan KCKT dengan fase gerak metanol-air-asam fosfat (50:49,8:0,2 v/v/v) belum bersifat stability indicating assay.
4.2.	Saran 
Dari penelitian ini disarankan :
1.	Untuk menggunakan metode lain dalam peningkatan kelarutan kuersetin melalui pembentukan garam dengan senyawa basa yang tepat seperti dari golongan asam-asam amino. 
2.	Mengembangkan metode analisis lain yang lebih bersifat stability indicating assay. 

DAFTAR PUSTAKA

Albert, A. & E. P. Serjeant. 1971. The Determination of Ionization                  Constant, A Laboratory manual. Second edition. Chapman and Hall Ltd, London. 115 p.

Ainley, W & P. J. Weller. 1994. Handbook of Pharmaceutical Excipient, Second edition. The Pharmaceutical Press, London.  p: 186-189.

Anonim. 1983. The Merck Index, An Encyclopedia of Chemicals and Drug, Ninth Edition, Merck and Co., Inc, Rahway, New Tersey, USA. p: 7936.

Ansel, H. C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Edisi keempat. Diterjemahkan oleh Farida Ibrahim. Penerbit Universitas Indonesia (UI Press). hal 143.

Arbain, D. 2004. Dua Dekade Penelitian Kimia Tumbuhan Sumatera, Bul. Soc. Nat. Prod. Chem. (Indonesia). 4 : 1-12

Aron, P. M. 2007. Composition of Flavonoid Phenolic Polymers Isolated from Red Wine During Maceration and Significance of Flavan-3-0ls in Foods Pertaining to Biological Activity. Thesis. Oregon State University.

Bachtiar, A., 1992. Isolasi Rutin dari Daun Ubi Kayu Manihot uttilisima Menggunakan Resin Amberlit (XAD-4). Laporan Penelitia. SPP/DPP No. 09/PP UA/SPP/DPP-01/1991. Pusat Penelitian Universitas Andalas, Padang.

Balasubramanian, S. 2002. Dose and Vehicle Effects on The Penetration Rate os Selected Plant Polyphenols Through Human Skin. Thesis. Departement of Pharmaceutical and Cosmetic Sciences of the College of Pharmacy, University of Mumbay.

Carstensen, J. T., 1996. Preformulation. In Modern Pharmaceutics. Third edition. Marcel Dekker Inc. New York. p: 213-237

Cartensen, J. T. 1990. Drug Stability, Priciples and Practice. Marcel Dekker, Inc. New York.

Challa, R., A. Ahuja., J. Ali & R. K. Khar. 2005. Cyclodextrins in Drug Delivery: An Update Review. AAPS PharmSciTech. 6 (2) Artcle 43 : E329-E350.

Connors, A. K., G. L. A. Amidon & V. J. Stella. 1985. Stabilitas Kimiawi Sediaan Farmasi. edisi II. Diterjemahkan oleh Drs. Achmad Mustofa Fatah, Apt. IKIP Semarang Press, Semarang.

Dangles, O., G. Fergeix & C. Dufour. 2000. Antioxidant properties of anthocyanins and tannins: a mechanistic investigation with catechin and the 3′, 4′,7-trihydroxyflavylium ion. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2: 1653-1663
Harborne, J. B., T. J. Mabry, & H. Mabry. 1982. The Flavonoids. Chapman and Hall, London. p: 297-324.

Haslam, E. 1966. Chemistry of Vegetable Tannins, Academic Press. London and New York. p: 30-83

Herrero-Martinez, J. M., M. Sanmartin, M. Roses, E. Bosch & C. Rafols. 2006. Determination of Dissociation Constants of Flavonoids by Capilarry Electrophoresis (Abstract). Departement de Quimica Analitica, Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain.

Higuchi, T & K.A. Connors. 1965. Phase Solubility Technique. Adv. Anal Chem Instrum. Vol. 4 . p: 117-210.

Isadiartuti, D., B. Widjaja., A. Radjaram., M.A. Syamsur & D. Setyawan. 2001. Upaya Peningkatan Kelarutan Pinostrobin dengan Senyawa Inklusi β-Siklodekstrin dan Hidroksipropil β-Siklodekstrin, Majalah farmasi Airlangga, vo. 1. No. 3 : 31-36.
James, K. C. 1986. Solubility and Related Properties. Marcel Dekker, inc. USA. p: 36-59, 251-277.

Kooter, I. M., R. A. Steiner, B. W. Dijikstra, P. I. van Noort, M. R. Egmond & M. Huber. 2002. EPR Characterication of the Mononuclear Cu-Containing Aspergillus japonicus Quercetin 2,3-Dioxygenase Reveals Dramatic Changes Upon Anaerobic Binding of Substrates. Eur. J. Biochem. 269 : 2971-2979.

Kriz, Z., J. Koca., A. Inverti., A. Charlot & R. Auzely-Velty. 2003. Investigation of The Complexation (+)-Catechin by β-cyclodextrin by A Combination of NMR, Microcalorimetry and Molecular Modeling Techniques. Org. Biomol. Chem. 1 : 2590-2595.

Lachman, L., H. A, Lieberman, H. A., & J. L. Kanig. 1989. Teori dan Praktek Farmasi Industri. Edisi ketiga. Jilid 1. Diterjemahkan oleh Siti Suyatmi. Penerbit Universitas Indonesia (UI-Press). hal. 371.

Lucida, H., J. E. Parkin & V.B. Sunderland. 2000. Kinetic Study of the Reaction of Sulfamethoxazole and Glucose Under Acidic Conditions: I. Effect of pH and Temperature. Int. J. Pharm. 202 : 47-61.

Markham, K. R.. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Penerbit ITB Bandung. 

Martin, A. J., Swarbrick & A. Cammarata. 1990. Farmasi Fisika, Dasar-dasar Kimia Fisik dalam Ilmu Farmasetik. Jilid I. Edisi III. diterjemahkan oleh Yoshita. Universitas Indonesia Jakarta.

Martin, H. F. P., J. P. Leal., M. T. Fernandez., V. H. C. Lopes & N. D. S. Cordeiro. 2004. Toward the Prediction of the Activity of Antioxidants: Experimental and Theoretical Study of the Gas-Phase Acidities of Flavonoids. Joornal of the American Society for Mass Spectrometry. Volume 15. Issue 6 : 848-861.

Martindale. 1999. The Complete Drug Reference. Thirty-second edition. Edited by Kathleen Parfitt. Pharmaceutical Press. p: 1580.

Mielczarek, C. 2005. Acid-Base Properties of Selected Flavonoid Glycosides. European Journal of Pharmaceutical Sciences. Volume 25. Issues 2-3 : 273-279.

NAPRALERT (SM). 1997. Biological Activities of Quercetin. Program for Collaborative Research in the Pharmaceutical Scienes, within the Departement of Medical Chemistry and Pharmacognosy, in the College of Pharmacy of the University of Illinois at Chicago.

Painter, F. M. 1998. Monograph Quercetin. Alternative Medicine Review. Volume 3, Number 2. 
Pandit, N. K & J. M. Sisco. 1989. The Determination of Microscopic Ionization Constants of A Substituted Piperazine Using Estimates from Model Compounds. Pharmaceutical Research. Vol. 6. No. 2. : 177-181.

Parrot, E. I. 1970. Pharmaceutical Technology, Burgess Publishing Company United States of America. p: 209

Patil, B. S., L. M. Pike & B. K. Hamilton. 1995. Changes in Quercetin Concentration in Onion Growth Stage and Soil Type. New Phytol. 130 : 349-355.

Remington’s Pharmaceutical science. 1990. 18th ed., Mack Printing Company, Easton, Pennsylvania.

Salter, D. W., S. Custead-Jones & J. S. Cook. 1978. Quercetin Inhibits Hexose Transport In A Human Diploid Fibrioblast. J Membr Biol. 40(1) : 67.

Sauerwald, N., M. Schwenk,  J. Polster & E. Bengsch. 1998. Spectrometric pK Determination of Daphnetin, Chlorogenic Acid and Quercetin. Z. Naturforsch. 53 b. : 315.

Soediro, I., K. Padmawinata, S. Soetarno & Moesdarsono, 1984, Isolasi Rutin dari Beberapa Tumbuhan Indonesia, Laporan Penelitian, Institut Teknologi Bandung.

Stewart, P. J & I. G. Tucker. 1986. Prediction of Drug Stability-Part 6: Stability Trials. Aust  J Hosp Pharm. Vol. 16. No. 1. : 35-43.

Sutthiparinyanont, S., A. Priprem & M. Chulasiri. 2006. Quercetin: Characterization and Development of Liposomal Encapsulation for Drug Delivery System. Faculty of Pharmaceutical Sciences, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand.

Syamsuhidayat, S. D., 1991, Inventaris Tanaman Obat Indonesia (I). Depkes RI, Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Jakarta.

Sykes, P. 1986. A Guide Book to Mechanism in Organic Chemistry, 6th ed. , Longman Scientific & Technical, Harlow.

Szejtli, J. 1997. Utilization of Cyclodextrins in Industrial Products and Processes. J. Mater. Chem. 7(4). 575-587.

Tahir, S. 1997. Kromatografi Cair kinerja Tinggi (KCKT), Dasar Instrumentasi serta Perawatan, Masalah, Penyebab dan Pemecahannya. Bahan Pelatihan KCKT. Pusat Pemeriksaan Obat dan Makanan, Ditjen POM, Depkes RI. 66 hal.

Tokusoglu, O., M. K. Unal & Z. Yildirim. 2003. HPLC-UV and GC-MS Characterization of The Flavonol Aglycons Quercetin, Kaempferol, and Myricetin in Tomato Pastes and Other Tomato-Based Products. Acta Chromatographica. No. 13 : 196-203.

Torreggiani, A., M. Tamba, A. Trinchero & S. Bonora. 2005. Copper(II)-Quercetin Complexes in Aqueous Solutions: Spectroscopic and Kinetic Properties. J. Mol. Struc. 744-747 : 759-766.

Van Der Woude, H. 2006. Mechanisms of Toxix Action of The Flavonoid Quercetin and Its Phase II Metaboliets, Thesis, Wageningen University, Wageningen, the Netherlands : 18..

Van Dijk, C., A. J. M. Driessents & K. Recourt. 2000. The Uncoupling Efficiency and Affinity of Flavonoids for Vesicles. Biochemical Pharmacology. Vol. 60. : 1593-1600.

Webb, M. R & S. E. Ebeler. 2004. Comparative Analysis of Topoisomerase IB Inhibition and DNA Intercalation by Flavonoids and Similar Compounds: Structural Determinates of Activity. Biochem J. 384(Pt 3): 527-541.

Wells, J. I. 1988. Pharmaceutical Preformulation, The Physicochemical Properties of Drug Substance, Ellis Horwood Limited, New York. p. 14-28
Yalkowsky, S. H.1981. Techniques of Solubilization of Drugs. Marcel Dekker, New York. p: 135-157.

Yuwono, M., M. Mulja & G. Indrayanto. 1999. HPLC. Materi Kursus HPLC. Unit Layanan Konsultasi, Pengujian dan Kerjasama Penelitian, Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya. 59 hal.

Zenkevich, I. G., A. Y. Eshchenko, S. V. Makarova, A. G. Vitenberg, Y. G. Dobryakov & V. A. Utsal. 2007. Identification of the Products of Oxidation of Quercetin by Air Oxygen at Ambient Temperature. Molecules. 12 : 654-672.

Zenkevich, I. G & A. I. Pimenov. 2003. On The Reasons of Anomalous UV-Spectrum of Quercetin Pentaacetate. Rastit. resur. Vol. 39. Number 2. p: 120.

Zenkevich, I. G., A. Y. Eshchenko, S. V. Makarova, & V. G. Makarov. 2006. Unusual Chemical Transformation of Natural Flavonoids. Planta Med. 72. 

Zheng, Y., I.S. Haworth., Z. Zuo., M.S. Chow & A.H. Chow. 2005. Physicochemical and Structural Characterization of Quercetin-Beta-Cyclodextrin Complexes. J. Pharm. Sci. 94(5): 1079-89.